Принцип работы

До недавнего времени секвенирование ДНК (оптимальное по соотношению цена/ качество) могло быть выполнено только с использованием технологий с короткими ридами (<300 п.н. – в настоящее время Illumina, BGI). В настоящее время появились технологии Oxford Nanopore, способные обрабатывать протяжённые фрагменты ДНК (до 1,2 млн пар), что дает ряд значительных преимуществ: (а) лёгкость сборки, (б) секвенирование повторяющихся геномных областей, (в) выявление больших структурных вариаций, (г) высокая точность после сборки консенсуса.

В отличие от других платформ NGS (для детекции используют вторичный сигнал: свет, цвет или рН), секвенсоры Oxford Nanopore Technology (ONT) определяют непосредственно состав нативной молекулы одноцепочечной ДНК.

Ключевым компонентом секвенаторов ONT является проточная ячейка, в камере которой содержится непроводящая мембрана (в растворе электролита) со встроенными проводящими белковыми нанопорами. Принцип секвенирования ONT основан на измерении электрического тока при прохождении молекулы нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) через нанопору [Бородинов et al., 2020]

В процессе пробоподготовки к концам фрагментов нуклеиновых кислот пришиваются специальные моторные белки. При попадании образца в камеру проточной ячейки эти белки связываются с нанопорами. Под действием электрического поля (в присутствии АТФ) моторные белки расплетают двуцепочечную нуклеиновую кислоту и направляют одну из цепей в нанопору (при этом вторая цепь может присоединиться к соседней поре либо остаться в растворе). Дальнейшее движение ДНК или РНК через канал осуществляется за счет отрицательного заряда. Одновременно с нуклеиновой кислотой через каналы движутся ионы, содержащиеся в растворах электролитов. Поскольку размер нуклеотидов неодинаков, величина ионного тока зависит от последовательности участка нуклеиновой кислоты, проходящего через канал в заданный момент времени. Изменения напряжения характеризуют последовательность ДНК или РНК в поре. Последовательность интерпретируется, как k-мер. В процессе интерпретации сигнала прибор анализирует более 1000 потенциальных k-меров (не только сигналы отдельных нуклеотидов), учитывает модифицированные основания, присутствующие в нативной ДНК или РНК. Для обработки сигналов используется специализированное программное обеспечение с искусственным интеллектом.

В настоящее время доступны приборы для проведения полногеномных исследований в лаборатории (GridION, PromethION), а также портативные устройства, которые могут быть предназначены для «полевых» исследований (MinION).

Технология ONT легко масштабируется, что позволяет пользователям выбирать устройство, производительность которого удовлетворяет конкретным требованиям проекта. PromethION 48 идеально подходит для крупных популяционных полногеномных. С использованием PromethION в сочетании с программным обеспечением ONT были получены полные геномы 11 линий клеток человека всего за 9 дней (сгенерировано 2.3 ТБ последовательности со средней глубиной покрытия x63/ образец) [Shafin et al., 2020].

Характеристики технологии:

• длина чтений – до 1.2 млн п.о. и выше (есть данные – до 10 млн. п.о.)
• возможность парноконцевых чтений – наличие
• точность при детекции SNP человека (поколение химии – R9.4.1, покрытие – 50, ПО – Medaka, EPI2ME Labs tutorial) – 99.92% [Oxford Nanopore., 2021]
• точность при детекции SV человека (поколение химии – R9.4.1, покрытие – 50, ПО – EPI2ME workflow, github pipeline, EPI2ME Labs tutorial) – 97.5%

Технические характеристики

Материалы